蛋白泛素化水平检测

(CMA)     (ISO) (高新技术企业)

蛋白泛素化水平检测方案

1. 检测范围 蛋白泛素化水平检测适用于以下样本类型：

• 细胞系：包括原代细胞、肿瘤细胞系（如HeLa、HEK293）及基因编辑后的细胞模型。
• 组织样本：如小鼠/大鼠的肝脏、脑组织或肿瘤组织。
• 体液样本：血清、血浆或脑脊液中的可溶性泛素化蛋白。
• 疾病模型：神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、癌症或炎症性疾病相关样本。
• 药物处理组：评估药物或小分子抑制剂对泛素-蛋白酶体系统的影响。

2. 检测项目 检测涵盖以下泛素化相关指标：

• 总泛素化水平：通过泛素抗体检测样本中泛素化蛋白的总体丰度。
• 特异性底物泛素化：针对特定靶蛋白（如p53、IκBα）的泛素化修饰水平。
• 泛素链类型分析：区分K48（降解信号）、K63（非降解信号）或其他类型聚泛素链。
• 泛素化动态变化：时间依赖性泛素化修饰（如刺激后0/30/60分钟）及剂量效应分析。

3. 检测仪器

• Western blot系统：包括电泳仪（Bio-Rad Mini-PROTEAN）、转膜仪及化学发光成像系统（ChemiDoc MP）。
• 质谱仪：高分辨率液相色谱-质谱联用仪（Thermo Fisher Orbitrap Fusion）用于泛素化位点鉴定。
• 荧光显微镜：共聚焦显微镜（Zeiss LSM 900）检测免疫荧光标记的泛素化信号。
• RT-qPCR仪：定量检测泛素相关基因（如UBE2D1、USP7）的表达水平。
• 多功能酶标仪：检测泛素化活性相关试剂盒（如Boston Biochem Ubiquitinylation Kit）。

4. 检测方法 4.1 样本制备

• 裂解液配方：RIPA缓冲液（含1% NP-40、0.1% SDS）添加蛋白酶抑制剂（Roche cOmplete）及去泛素化酶抑制剂（PR-619）。
• 离心条件：4℃下14,000×g离心20分钟，取上清进行后续分析。

4.2 Western blot检测

• 电泳与转膜：使用4-12%梯度胶分离蛋白，湿转法转移至PVDF膜。
• 抗体孵育：一抗为泛素单克隆抗体（Cell Signaling Technology 3936，1:1000）或底物特异性抗体；二抗为HRP标记抗兔IgG（1:5000）。
• 信号采集：ECL发光试剂显影，Image Lab软件定量条带灰度值。

4.3 免疫荧光染色

• 固定与透化：4%多聚甲醛固定细胞15分钟，0.1% Triton X-100透化10分钟。
• 抗体标记：Cy3标记泛素抗体（Abcam ab72592）与DAPI共染，Z-stack扫描获取三维图像。

4.4 质谱分析

• 泛素化肽段富集：使用TUBE（Tandem Ubiquitin-Binding Entity）技术特异性捕获泛素化蛋白。
• 数据分析：通过MaxQuant软件匹配UniProt数据库，筛选泛素化位点（修饰残基为K-ε-Gly-Gly）。

4.5 实时泛素化活性检测

• 体外泛素化反应：重组E1酶（UBE1）、E2酶（UBE2D1）及E3连接酶（MDM2）孵育底物蛋白，ATP再生系统维持反应。
• 终止与读数：加入SDS上样缓冲液终止反应，通过荧光标记泛素（Ub-AMC）实时监测酶活。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。