蛋白互作检测

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蛋白互作检测技术概述

1. 检测范围 蛋白互作检测主要针对生物体内蛋白质之间的物理结合或功能关联，适用于细胞裂解液、组织匀浆液、纯化蛋白样本及体液（如血清、脑脊液）等。检测范围涵盖直接相互作用（如酶-底物结合）和间接相互作用（如信号通路中的多蛋白复合体），适用于基础研究、药物筛选及疾病标志物鉴定等领域。

2. 检测项目 （1）免疫共沉淀（Co-IP）：验证目标蛋白与其潜在结合蛋白在天然状态下的相互作用。 （2）荧光共振能量转移（FRET）：实时监测活细胞内两个荧光标记蛋白的近距离结合（<10 nm）。 （3）表面等离子体共振（SPR）：定量分析蛋白间结合的动力学参数（如结合速率、解离常数）。 （4）酵母双杂交系统：筛选与目标蛋白相互作用的候选蛋白，适用于大规模互作组学研究。

3. 检测仪器 （1）SPR检测仪：如Biacore系列，通过芯片表面折射率变化实时记录结合过程。 （2）荧光显微镜/共聚焦显微镜：用于FRET实验中荧光信号的捕获与分析。 （3）质谱仪（LC-MS/MS）：配合Co-IP或Pull-down技术鉴定互作蛋白的组成。 （4）微孔板读数仪：用于ELISA或AlphaScreen等高通量互作检测的信号读取。

4. 检测方法 （1）Co-IP实验流程：

• 样本处理：裂解细胞或组织，保留蛋白天然构象。
• 抗体孵育：使用目标蛋白特异性抗体与样本孵育，形成抗原-抗体复合物。
• 沉淀分离：通过Protein A/G磁珠捕获复合物，洗涤去除非特异性结合。
• Western Blot验证：电泳分离后，用二抗检测共沉淀蛋白。

（2）FRET技术要点：

• 荧光标记：供体蛋白（如CFP）与受体蛋白（如YFP）分别标记目标蛋白。
• 激发与检测：使用供体激发波长（如433 nm），通过受体发射波长（如527 nm）判定能量转移效率。

（3）SPR操作步骤：

• 芯片固定：将诱饵蛋白偶联至传感器芯片表面。
• 样品注入：使猎物蛋白溶液流经芯片，实时监测结合信号（RU值）。
• 数据分析：通过Scrubber或BIAevaluation软件计算动力学参数。

（4）酵母双杂交系统：

• 载体构建：将诱饵蛋白与DNA结合域（BD）融合，猎物蛋白与激活域（AD）融合。
• 共转化筛选：在缺陷培养基中筛选阳性克隆，通过报告基因（如LacZ）表达确认互作。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。