细胞培养中支原体检测

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细胞培养中支原体检测技术要点

一、检测范围

支原体检测覆盖各类细胞样本，包括实验室常规细胞系（如HEK293、HeLa、CHO）、原代细胞、干细胞、免疫细胞等。在生物制药领域，需重点检测疫苗生产用细胞（如Vero细胞）、基因治疗载体生产细胞及细胞治疗产品。临床样本如骨髓、脐带血来源的细胞也需纳入检测范围。交叉污染风险环节包括细胞冻存/复苏、共培养操作、血清或培养基污染等。

二、检测项目

1. 定性检测：确定样本是否存在支原体污染（检出限＜10 CFU/mL）
2. 种属鉴定：通过基因分型确认污染菌种，常见包括M. orale（口腔支原体）、M. hyorhinis（猪鼻支原体）、M. arginini（精氨酸支原体）等
3. 定量分析：特殊场景下检测污染浓度（如治疗性细胞产品疗效评估）
4. 耐药性检测：针对抗生素处理后的细胞进行耐药支原体筛查

三、检测仪器

四、检测方法

1. 培养检测法（金标准）

• 原理：采用SP4液体培养基（含10%马血清）+琼脂固体培养基双相培养
• 操作：样本接种后37℃培养28天，每周观察培养基颜色变化及菌落形态
• 优势：检出率＞95%，可分离活菌
• 局限：检测周期长（4周），无法检测不可培养支原体

2. PCR检测法

• 引物设计：针对16S rRNA基因保守区（通用引物组：GPO-3/MGSO）
• 流程：DNA提取→预混液配制（含dNTP、Taq酶）→扩增程序（95℃ 5min; 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 45s×40循环）
• 灵敏度：可检测10-100 copies/μL，配套电泳或探针法判读

3. 荧光染色法（Hoechst 33258法）

• 染色体系：0.05 μg/mL Hoechst 33258 + 固定液（甲醇:冰乙酸=3:1）
• 观察标准：细胞核外周出现亮蓝色荧光颗粒（400×镜下＞5个荧光点/视野判定阳性）
• 注意事项：需设立已知阴性/阳性对照，排除DNA碎片干扰

4. ELISA检测

• 试剂盒组成：包被支原体膜蛋白的96孔板，HRP标记二抗
• 检测流程：样本孵育（37℃ 1h）→洗板→显色（TMB底物）→酶标仪读数
• 特点：适用于大规模筛查，但存在抗体交叉反应风险

5. 宏基因组测序法

• 建库策略：采用Nextera XT DNA Library Prep Kit构建小片段文库
• 数据分析：比对NCBI支原体专属数据库（Mycoplasma_16S_RefSeq）
• 优势：可检测未知种属，精确识别混合感染
• 应用限制：成本较高（约$300/样本），需专业生物信息分析

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。