蛋白序列检测

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蛋白序列检测技术报告

一、检测范围

1. 蛋白类型：涵盖重组蛋白、抗体、酶类、细胞因子、血浆蛋白及天然提取蛋白。
2. 序列长度：适用于50至5000个氨基酸残基组成的蛋白序列。
3. 样本来源：包括哺乳动物细胞表达系统、原核表达系统（如大肠杆菌）、酵母表达系统及体外合成多肽。

二、检测项目

1. 序列覆盖度分析：检测目标蛋白的氨基酸序列与理论序列的匹配程度，识别缺失或错误拼接区域。
2. 氨基酸组成分析：定量分析蛋白中20种标准氨基酸的比例，验证序列正确性。
3. 翻译后修饰（PTM）检测：包括磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化等修饰位点的鉴定与定量。
4. 二硫键定位：确定半胱氨酸残基间的二硫键连接模式。
5. 蛋白纯度评估：检测样本中目标蛋白的占比及杂质（如宿主蛋白、降解片段）含量。

三、检测仪器

1. 质谱仪：
   • 高分辨液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）：Thermo Fisher Orbitrap Fusion Lumos、Sciex TripleTOF 6600。
   • 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）：Bruker UltrafleXtreme。
2. 高效液相色谱（HPLC）系统：Agilent 1260 Infinity II（用于肽图分析和纯度检测）。
3. Edman降解测序仪：Applied Biosystems Procise 494（用于N端序列验证）。
4. 毛细管电泳系统：Beckman Coulter PA 800 Plus（用于纯度及分子量分析）。

四、检测方法

1. 样本制备

   • 还原烷基化处理：使用二硫苏糖醇（DTT）还原二硫键，碘乙酰胺烷基化封闭游离巯基。
   • 酶解消化：采用胰蛋白酶（Trypsin）、Lys-C或Glu-C对蛋白进行特异性切割，生成肽段混合物。

2. 质谱分析

   • 数据依赖性采集（DDA）：通过LC-MS/MS对肽段进行分离与碎裂，获取肽段一级和二级质谱数据。
   • 数据非依赖性采集（DIA）：利用宽窗口碎裂模式提高翻译后修饰检测的覆盖度。

3. 数据分析

   • 数据库搜索：使用MaxQuant、Proteome Discoverer等软件，比对UniProt、NCBI数据库中的理论序列。
   • 修饰位点验证：通过碎片离子匹配（如b/y离子）及保留时间校准（RT Alignment）提高定位精度。
   • 二硫键解析：结合非还原电泳与质谱数据，通过Disulfide by Design 2.0软件预测结合模式。

4. 纯度检测

   • 反相HPLC：C18色谱柱分离，紫外检测器（214 nm）定量目标蛋白峰面积占比。
   • SDS-PAGE与毛细管电泳：考马斯亮蓝染色或激光诱导荧光检测（LIF）评估分子量均一性。

五、质量控制标准

• 序列覆盖度≥95%（全长蛋白），关键功能域（如抗体CDR区）覆盖度100%。
• 翻译后修饰检测灵敏度达0.1%修饰丰度，假阳性率＜1%。
• 纯度检测要求目标蛋白占比≥90%（药物级标准）或≥80%（研究级标准）。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。