蛋白泛素化检测

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蛋白泛素化检测范围

蛋白泛素化检测适用于多种生物样本，包括但不限于：

1. 细胞系：如肿瘤细胞、原代细胞或基因编辑细胞（如CRISPR敲除/过表达泛素化相关基因的模型）。
2. 动物组织：如小鼠、大鼠等疾病模型中的脑、肝、肾等器官组织。
3. 临床样本：肿瘤组织、血液或体液中的泛素化蛋白分析。
4. 体外泛素化体系：重组蛋白与泛素化酶（E1、E2、E3）及去泛素化酶（DUB）的体外反应系统。

蛋白泛素化检测项目

1. 泛素化蛋白的定性与定量：检测目标蛋白是否发生泛素化修饰及修饰水平（如整体泛素化或特异性底物泛素化）。
2. 泛素链类型分析：鉴定多聚泛素链的连接方式（如K48、K63、K11等），解析其功能差异。
3. 去泛素化酶活性检测：评估DUB对泛素链或泛素化底物的水解能力。
4. 泛素化位点鉴定：通过质谱技术精确定位蛋白上泛素修饰的赖氨酸（K）位点。
5. 动态泛素化分析：研究药物处理、基因干预或病理状态下泛素化水平的时序性或剂量依赖性变化。

蛋白泛素化检测仪器

1. Western Blot系统：包括电泳仪（如Bio-Rad Mini-PROTEAN）、转膜仪及化学发光成像系统（如Amersham Imager 600），用于泛素化蛋白的免疫印迹分析。
2. 质谱仪：高分辨率液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS，如Thermo Fisher Q Exactive），用于泛素化位点及泛素链类型的精确鉴定。
3. 荧光成像系统：如共聚焦显微镜（Zeiss LSM 900）或多功能酶标仪（如PerkinElmer EnVision），用于免疫荧光或荧光标记泛素探针的检测。
4. 酶标仪：用于ELISA或基于FRET（荧光共振能量转移）的泛素化定量分析。
5. 离心机与恒温设备：包括超速离心机（Beckman Coulter）和恒温摇床，支持样本制备与反应体系孵育。

蛋白泛素化检测方法

1. Western Blot法

   • 步骤：样本裂解（含蛋白酶/去泛素化酶抑制剂）→ SDS-PAGE分离→转膜至PVDF→抗泛素抗体（如抗Ub-K48/K63）或底物特异性抗体孵育→ HRP标记二抗显色。
   • 特点：成本低、适用广，但需特异性抗体且无法区分泛素链类型。

2. 免疫沉淀（IP）结合质谱

   • 步骤：泛素化蛋白经IP富集（如TUBE试剂捕获多聚泛素链）→ Trypsin酶切→ LC-MS/MS分析→数据库比对确定修饰位点。
   • 特点：高特异性，可同时分析泛素化位点与链类型。

3. 免疫荧光技术

   • 步骤：细胞固定→透膜处理→泛素化蛋白特异性一抗孵育→荧光二抗标记→共聚焦显微镜成像。
   • 特点：可视化泛素化蛋白的亚细胞定位（如核内或溶酶体周边）。

4. ELISA定量法

   • 步骤：包被抗泛素抗体→加入样本及生物素标记检测抗体→ Streptavidin-HRP显色→酶标仪测定吸光度。
   • 特点：高通量、定量精准，适用于临床样本筛查。

5. 去泛素化酶活性检测

   • 步骤：以荧光标记泛素底物（如Ub-AMC）或泛素-报告蛋白融合体为底物→加入DUB→检测荧光强度变化（Ex/Em=380/460 nm）。
   • 特点：实时监测DUB活性，适用于抑制剂筛选。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。