泛素化蛋白质组学检测

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泛素化蛋白质组学检测技术方案

1. 检测范围 泛素化蛋白质组学检测覆盖以下范围：

• 样本类型：细胞系、组织样本（如肿瘤、脑、肝脏等）、体液（血清、脑脊液）及外泌体等。
• 物种范围：人类、小鼠、大鼠及常见模式生物（如果蝇、斑马鱼）。
• 泛素化类型：单泛素化、多泛素化（K48、K63等链型）及类泛素化修饰（SUMO化、NEDD8化）。

2. 检测项目

• 泛素化位点鉴定：通过高精度质谱鉴定样本中泛素化修饰的赖氨酸（K）位点。
• 泛素化水平定量：基于非标记（Label-free）或同位素标记（TMT/iTRAQ）技术，分析泛素化蛋白表达量差异。
• 动态变化分析：时间依赖性泛素化修饰动态（如药物处理、应激反应）。
• 底物蛋白筛选：鉴定特定E3泛素连接酶或去泛素化酶（DUB）的靶标蛋白。
• 互作网络分析：泛素化修饰与其他翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化）的协同调控关系。

3. 检测仪器

• 质谱仪：
  • 高分辨质谱：Thermo Fisher Orbitrap Fusion Lumos、Q Exactive HF-X（分辨率≥240,000，质量精度<3 ppm）。
  • 数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）模式。
• 液相色谱系统：EASY-nLC 1200或UltiMate 3000纳升液相系统，C18反相色谱柱（75 μm×25 cm）。
• 样品前处理设备：超声破碎仪（细胞裂解）、超速离心机（细胞器分离）、磁珠分离系统（泛素化肽段富集）。
• 数据分析软件：MaxQuant（泛素化位点鉴定）、Skyline（定量分析）、STRING（互作网络构建）。

4. 检测方法 4.1 样本制备

• 蛋白提取与还原烷基化：裂解液（8 M尿素，1% SDS）提取总蛋白，DTT还原二硫键，碘乙酰胺烷基化封闭。
• 酶解处理：Trypsin/Lys-C混合酶（37℃, 16 h）酶解为肽段，脱盐后冻干保存。

4.2 泛素化肽段富集

• 抗体亲和富集：使用抗K-ε-GG单克隆抗体偶联磁珠（如PTMScan Ubiquitin Remnant Motif Kit），特异性捕获泛素化修饰肽段。
• 化学富集：TiO2或IMAC（固定化金属离子亲和色谱）辅助去除非修饰肽段干扰。

4.3 质谱分析

• 色谱梯度：90 min梯度（5%-35%乙腈，0.1%甲酸），流速300 nL/min。
• 质谱参数：
  • 一级扫描：m/z 350-1500，分辨率120,000。
  • 二级扫描：HCD碎裂（NCE 28%），分辨率15,000。
  • 动态排除：30 s。

4.4 数据解析

• 数据库搜索：UniProt物种特异性数据库，允许修饰包括K-ε-GG（泛素化）、氧化（M）、乙酰化（N端）。
• 假阳性控制：反向数据库评估，FDR≤1%。
• 定量分析：LFQ强度归一化（MaxQuant），ANOVA/PCA分析差异泛素化蛋白。

4.5 验证实验

• Western blot：针对关键泛素化蛋白（如p53、IKBα）进行泛素化抗体验证。
• IP-MS：免疫共沉淀联合质谱验证E3酶与底物互作。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。