蛋白结构检测

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蛋白结构检测技术规范

1. 检测范围 蛋白结构检测涵盖天然蛋白、重组蛋白、酶、抗体、膜蛋白及病毒蛋白等多种类型，适用于药物靶点筛选、疾病机制解析、生物催化剂设计及蛋白质工程改造等领域。检测对象包括单体、复合物及动态构象变化体系，分子量范围覆盖5 kDa至2 MDa。

2. 检测项目

• 一级结构分析：氨基酸序列验证、翻译后修饰（磷酸化、糖基化）定位
• 二级结构解析：α-螺旋、β-折叠、无规卷曲占比测定
• 三级/四级结构表征：三维空间构象、亚基组装模式、活性位点拓扑
• 动态行为研究：构象涨落、配体结合动力学、变构效应

3. 检测仪器

• 高分辨率X射线衍射仪（如Rigaku XtaLAB Synergy-S）：适用于0.8 Å级原子分辨率结构解析
• 冷冻透射电镜（Cryo-EM, 如Thermo Fisher Titan Krios）：支持近原子级（1.8-3.5 Å）大分子复合物成像
• 核磁共振波谱仪（NMR, 如Bruker 800 MHz）：实现溶液态蛋白质动态结构分析
• 圆二色光谱仪（CD Spectrometer）：快速测定溶液环境二级结构变化
• 生物膜干涉仪（BLI, 如Fortebio Octet）：实时监测蛋白-配体相互作用动力学

4. 检测方法 4.1 X射线晶体学

• 结晶优化：采用坐滴气相扩散法，筛选2000+条件获得衍射级单晶
• 数据采集：同步辐射光源（λ=0.977 Å）收集＞180°旋转数据，分辨率限设定为1.6 Å
• 相位解析：通过分子置换（Phaser）或硒代甲硫氨酸单波长反常散射（SAD）
• 模型优化：Coot软件手动修正，PHENIX进行各向异性B因子精修

4.2 冷冻电镜单颗粒分析

• 样品制备：Quantifoil铜网经辉光放电处理，Vitrobot系统实现毫秒级玻璃化冷冻
• 数据采集：在300 kV加速电压下，以0.8-1.5 μm欠焦量采集10,000+颗粒图像
• 三维重构：Relion 4.0进行2D分类、3D初始模型构建及非均匀性优化
• 局部分辨率评估：ResMap计算局部分辨率分布图，确保活性区域达2.5 Å可信度

4.3 核磁共振技术

• 同位素标记：大肠杆菌表达体系制备^15N/^13C双标记样品，浓度＞0.3 mM
• 多维谱采集：包括HSQC、TROSY、NOESY等脉冲序列，HNCACB实现主链归属
• 结构计算：CYANA进行距离几何模拟，AMBER力场完成分子动力学优化

4.4 微量热泳动分析（MST）

• 荧光标记：Monolith NT.115系统兼容His标签靶向荧光染料（如MO-L008）
• 结合常数测定：16点浓度梯度（0.1 nM-100 μM）下监测热泳迁移率变化
• 数据拟合：NT Analysis软件采用单站点模型计算Kd值，误差范围＜15%

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。