细胞水平激酶检测

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细胞水平激酶检测技术概述

检测范围

细胞水平激酶检测主要针对激酶活性及其在细胞信号转导中的作用进行研究，涵盖以下范围：

1. 激酶家族分类：包括酪氨酸激酶（如EGFR、Src）、丝氨酸/苏氨酸激酶（如MAPK、AKT）、脂质激酶（如PI3K）等。
2. 细胞类型：适用于贴壁细胞（如HeLa、HEK293）、悬浮细胞（如Jurkat、U937）及原代细胞（如T细胞、神经元）。
3. 检测条件：涵盖基础生理状态、药物处理（如抑制剂或激动剂）、基因编辑（如CRISPR敲除/过表达）后的激酶活性变化。

检测项目

1. 激酶活性测定：通过底物磷酸化水平直接反映激酶活性。
2. 激酶磷酸化状态分析：检测激酶自身激活位点的磷酸化程度（如AKT Thr308/Ser473）。
3. 激酶-底物相互作用：验证特定底物与激酶的关联性（如p53与ATM激酶）。
4. 抑制剂/激活剂筛选：评估化合物对激酶活性的调控作用（如STI-571对Bcr-Abl的抑制）。
5. 信号通路动态监测：分析激酶上下游分子事件（如ERK激活后c-Fos表达）。

检测仪器

1. 酶标仪（Microplate Reader）：用于比色法（如ELISA）或荧光法（如AlphaScreen）检测磷酸化信号。
2. 流式细胞仪（Flow Cytometer）：实现单细胞水平激酶活性定量（如Phosflow技术）。
3. Western blot成像系统：通过化学发光或荧光检测磷酸化蛋白条带。
4. 质谱仪（Mass Spectrometer）：用于激酶底物的全局磷酸化组学分析。
5. 高通量筛选平台（HTS）：自动化处理大规模激酶抑制剂库的筛选。

检测方法

1. 免疫学检测法

   • ELISA：利用磷酸化特异性抗体捕获底物，通过酶标二抗显色定量。
   • Western blot：分离细胞裂解物中的蛋白，检测目标激酶或底物的磷酸化水平。
   • 流式细胞术：固定细胞后，采用荧光标记抗体直接标记胞内磷酸化蛋白。

2. 放射性同位素法

   • 32P-ATP标记：将放射性γ-32P-ATP加入反应体系，通过放射自显影或闪烁计数法测定底物磷酸化强度。

3. 荧光共振能量转移（FRET）

   • 构建激酶与底物的FRET探针，实时监测活细胞内激酶活性动态变化。

4. 激酶活性传感器

   • 使用荧光报告基因（如Kinase Translocation Reporter, KTR）或生物发光探针（如NanoLuc）间接反映激酶活性。

5. 高通量化学发光法

   • 如ADP-Glo™技术：检测激酶反应中生成的ADP，适用于384孔板规模的抑制剂筛选。

（全文结束）

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。