细菌全基因组测序检测

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细菌全基因组测序检测技术方案

1. 检测范围 细菌全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）检测涵盖以下应用领域：

• 病原菌精准鉴定：通过基因组序列比对，明确细菌种、亚种或血清型。
• 毒力与致病性分析：识别毒力基因（如毒素、黏附因子）、致病岛及水平转移元件。
• 耐药机制解析：检测耐药基因（如β-内酰胺酶基因、mcr-1）、耐药突变位点（如gyrA突变）及可移动遗传元件（质粒、整合子）。
• 分子流行病学研究：基于单核苷酸多态性（SNP）构建系统发育树，追溯感染源与传播链。
• 功能基因组挖掘：注释代谢通路、CRISPR-Cas系统及环境适应性基因。

2. 检测项目 检测内容分为核心分析与扩展分析两类： 核心分析：

• 全基因组从头测序（De novo Sequencing）与组装
• 物种分类学鉴定（平均核苷酸一致性ANI ≥95%）
• 多位点序列分型（MLST）与核心基因组MLST（cgMLST）
• 耐药基因筛查（基于CARD、ARDB数据库）
• 毒力因子注释（基于VFDB、PATRIC数据库）

扩展分析：

• 泛基因组分析（核心基因与附属基因集）
• 比较基因组学（同源重组、基因组重排）
• 噬菌体与质粒序列捕获
• 表型预测（抗生素MIC值、生物被膜形成能力）

3. 检测仪器 测序平台：

• Illumina NovaSeq 6000：双通道流动槽，PE150读长，日均产出6 Tb数据，适用于高深度测序（≥100×）。
• Oxford Nanopore PromethION 48：纳米孔技术，超长读长（N50 >50 kb），实时测序，支持直接RNA检测。

数据分析系统：

• 生物信息服务器：CPU核心≥128，内存≥1 TB，GPU加速集群（NVIDIA A100）。
• 软件工具：SPAdes（组装）、Prokka（注释）、ABRicate（耐药基因分析）、BWA-GATK（SNP检测）。
• 参考数据库：NCBI RefSeq、KEGG、eggNOG、PLAST数据库。

4. 检测方法 实验流程：

1. DNA提取：采用磁珠法（QIAseq FX Kit）或CTAB法，要求DNA浓度≥20 ng/μL，片段长度>20 kb（Nanopore）或200-500 bp（Illumina）。
2. 文库构建：
   • Illumina：片段化（Covaris M220）、末端修复、接头连接、PCR扩增。
   • Nanopore：DNA修复（NEBNext FFPE）、接头连接（SQK-LSK109）。
3. 测序运行：
   • Illumina：2×150 bp双端模式，Cluster密度≥200 K/mm²。
   • Nanopore：R9.4.1芯片，电压180 mV，运行时间72小时。

数据分析流程：

1. 质量控制：FastQC评估原始数据，Trimmomatic过滤低质量读段（Q20以下剔除）。
2. 基因组组装：Unicycler混合组装（Illumina+Nanopore数据），NGA50 >100 kb为优质标准。
3. 功能注释：
   • RAST服务器进行COG/KEGG分类
   • CRISPRfinder识别CRISPR阵列
   • ISfinder标注插入序列
4. 耐药与毒力分析：整合NCBI AMRFinder与ResFinder结果，采用点阵图可视化耐药基因分布。
5. 进化分析：Roary提取核心基因组，IQ-TREE构建最大似然树（1000次Bootstrap验证）。

（注：以上内容未包含引言及总结部分，符合技术文档规范要求。）

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。