流式检测焦亡检测

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检测范围

流式检测焦亡（pyroptosis）适用于多种细胞类型，包括但不限于免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）、肿瘤细胞系（如THP-1、A549）、原代细胞及基因编辑细胞模型（如CRISPR/Cas9敲除特定基因的细胞）。检测可涵盖体外诱导的焦亡（如通过细菌毒素、化疗药物或病原体相关分子模式）及体内模型分离的细胞样本。

检测项目

1. 细胞膜完整性：通过膜不通透性染料（如PI、7-AAD）标记坏死或晚期焦亡细胞，区分活细胞与死亡细胞。
2. 焦亡特异性标志物：检测Gasdermin家族蛋白（如Gasdermin D）的剪切活化形式，或通过荧光标记抗体识别NLRP3炎症小体组分。
3. 炎症因子释放：联合检测胞内或胞外炎症因子（如IL-1β、IL-18）。
4. 线粒体功能：通过线粒体膜电位染料（JC-1、TMRE）评估线粒体损伤。
5. 细胞形态变化：结合侧向散射光（SSC）信号增强，反映细胞肿胀等形态特征。

检测仪器

1. 流式细胞仪：需配备多激光器（如488 nm、633 nm）及高灵敏度检测器，推荐型号包括BD FACSCanto II、Beckman CytoFLEX S。
2. 辅助设备：离心机（处理细胞沉淀）、CO₂培养箱（维持细胞活性）、荧光显微镜（预验证标记效果）。
3. 试剂与耗材：荧光标记抗体（如抗-GSDMD-C端抗体）、细胞膜染料（PI、7-AAD）、细胞刺激剂（尼日利亚菌素、LPS+ATP）、96孔板（用于高通量检测）。

检测方法

1. 样本处理：

   • 细胞经诱导焦亡后，收集上清（用于LDH或ELISA检测）及细胞沉淀。
   • 使用含钙离子的缓冲液重悬细胞，加入膜通透性染料（如5 μg/mL PI）及荧光抗体（如Alexa Fluor 647标记的Gasdermin D抗体），避光孵育15-20分钟。

2. 流式参数设置：

   • 前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）调整至区分细胞碎片与完整细胞。
   • 设置荧光通道：PI检测选用PE通道（Ex 488 nm/Em 610 nm），Gasdermin D抗体选用APC通道（Ex 640 nm/Em 660 nm）。
   • 补偿调节：通过单染样本校正荧光溢漏。

3. 数据分析：

   • 圈选活细胞群（PI阴性），进一步分析Gasdermin D阳性细胞比例。
   • 结合SSC信号增强（反映细胞肿胀）及PI阳性率，区分焦亡与凋亡或坏死。
   • 定量统计：使用FlowJo或BD FACSDiva软件计算焦亡细胞百分比及平均荧光强度（MFI）。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。