流式多色检测

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流式多色检测技术应用指南

检测范围

流式多色检测技术适用于以下领域：

1. 免疫学研究：免疫细胞分型（如T细胞、B细胞、NK细胞亚群）、细胞因子分泌分析、免疫激活状态评估。
2. 血液病诊断：白血病/淋巴瘤免疫分型、微小残留病灶（MRD）监测。
3. 肿瘤微环境分析：肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）表型及功能检测。
4. 细胞功能研究：细胞增殖、凋亡、细胞周期、活性氧（ROS）水平检测。
5. 感染性疾病：病毒宿主相互作用、病原体特异性免疫应答分析。 样本类型：外周血、骨髓、组织悬液、细胞培养物等单细胞悬液。

检测项目

1. 免疫表型标记物
   • T细胞亚群：CD3、CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO。
   • B细胞标记：CD19、CD20、CD27、IgD/IgM。
   • NK细胞标记：CD56、CD16、NKG2D。
2. 功能及活化标记物
   • 细胞因子：IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-17。
   • 活化/抑制分子：PD-1、CTLA-4、TIM-3、HLA-DR。
3. 细胞功能指标
   • 增殖：Ki-67、CFSE染色。
   • 凋亡：Annexin V、Caspase-3。
   • 代谢：线粒体膜电位（JC-1）、ROS（DCFH-DA）。
4. 多参数组合检测
   • 示例：Th1/Th2/Th17细胞亚群分析（CD4+ IFN-γ+/IL-4+/IL-17+）。

检测仪器

1. 流式细胞仪
   • 配置：3激光（488nm蓝激光、640nm红激光、405nm紫激光）系统，支持14色荧光检测通道。
   • 检测参数：前向散射（FSC）、侧向散射（SSC）及多色荧光信号。
2. 配套试剂与耗材
   • 荧光标记抗体：PE、FITC、APC、PerCP-Cy5.5、BV421等。
   • 缓冲液：PBS、破膜剂（用于胞内染色）、固定液。
3. 分析软件
   • 数据采集：BD FACSDiva™、Beckman Coulter Navios®。
   • 数据分析：FlowJo™、Kaluza®。

检测方法

1. 样本处理
   • 单细胞悬液制备：通过机械研磨或酶消化法处理组织样本，Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMC）。
   • 细胞染色：
     • 表面染色：抗体孵育（避光，4℃, 30分钟），PBS洗涤。
     • 胞内染色：固定破膜后加入胞内抗体（如细胞因子、转录因子）。
2. 抗体组合设计
   • 遵循“亮度匹配”原则：高表达标记物搭配弱荧光染料，低表达标记物搭配强荧光染料。
   • 避免光谱重叠：通过补偿矩阵校正荧光溢漏（如PE与PE-Cy7通道的交叉干扰）。
3. 仪器校准
   • 使用标准微球（如BD CompBeads）调整PMT电压，优化荧光信号分辨率。
   • 单阳性对照样本建立补偿矩阵。
4. 数据采集与分析
   • 阈值设定：排除碎片信号（FSC/SSC设门）。
   • 细胞亚群圈选：通过逐级设门（如淋巴细胞→CD3+→CD4+/CD8+）。
   • 荧光强度定量：MFI（平均荧光强度）或百分比统计。
5. 质量控制
   • 阴性对照：同型对照抗体排除非特异性结合。
   • 重复实验：确保染色一致性和数据可重复性（CV<5%）。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。