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技术概述

赖氨酸琥珀酰化修饰（Lysine Succinylation）是近年来发现的一种重要的蛋白质翻译后修饰类型，指在酶催化或非酶催化条件下，琥珀酰基团以琥珀酰辅酶A为供体，共价结合到蛋白质赖氨酸残基ε位氨基上的过程。该修饰于2011年首次被系统鉴定，此后在原核生物、真核生物以及哺乳动物中均被广泛发现，是目前蛋白质组学研究领域的热点方向之一。

从化学结构上看，赖氨酸发生琥珀酰化修饰后分子量增加100.0160 Da，且赖氨酸侧链由带正电荷转变为带负电荷，这种电荷状态的剧烈翻转比乙酰化、丙二酰化等修饰对蛋白质结构和功能的影响更为显著，可能改变蛋白质的酶活性、亚细胞定位、稳定性以及与其他分子的相互作用能力。研究表明，赖氨酸琥珀酰化修饰广泛参与糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸β氧化、氨基酸代谢等关键代谢通路的调控，并与肿瘤代谢重编程、心血管疾病、炎症反应、神经退行性疾病等多种病理过程密切相关。SIRT5是目前已知的主要去琥珀酰化酶，负责催化该修饰的动态逆转，与调控酶共同维持细胞内琥珀酰化修饰的动态平衡。

赖氨酸琥珀酰化修饰分析是利用高分辨质谱技术结合泛琥珀酰化抗体富集策略，对样品中发生琥珀酰化修饰的蛋白质及其修饰位点进行大规模定性鉴定和定量比较的研究手段，可系统揭示琥珀酰化修饰在生理和病理过程中的调控规律，为基础医学、代谢生物学、微生物学及植物科学研究提供重要数据支撑。

检测样品

赖氨酸琥珀酰化修饰分析适用于多种类型的生物样品，常见样品类别如下：

  • 动物组织样品：肝脏、心脏、脑、肾脏、脾脏、肌肉、肿瘤组织等；
  • 植物组织样品：叶片、根系、种子、花、果实、愈伤组织等；
  • 细胞样品：哺乳动物贴壁或悬浮细胞、原代细胞、酵母细胞、细菌菌体等；
  • 微生物样品：放线菌、真菌、工程菌株及其他微生物发酵产物；
  • 蛋白类样品：经提取纯化的总蛋白、亚细胞器蛋白、免疫沉淀获得的蛋白复合物等。

为保证检测结果的有效性，样品采集与运输环节需特别注意：样品应新鲜采集并迅速置于液氮速冻，随后转移至-80℃低温保存，全程避免反复冻融；寄送时建议使用足量干冰并选择冷链运输方式；蛋白质样品需注明缓冲液体系、蛋白浓度及大致体积等信息。由于琥珀酰化修饰丰度通常较低，全蛋白质组层面的琥珀酰化修饰组学分析一般需要毫克级蛋白起始量，具体送样要求可在项目开展前与技术支持人员沟通确认。

检测项目

赖氨酸琥珀酰化修饰分析涵盖从定性鉴定到深度生物信息学挖掘的完整服务内容，主要检测项目包括：

  • 琥珀酰化修饰位点的大规模定性鉴定与定位分析；
  • 琥珀酰化修饰蛋白及位点的定量分析（Label-free无标记定量、TMT/iTRAQ标记定量等）；
  • 两组或多组样品间差异琥珀酰化修饰蛋白及位点的筛选；
  • 琥珀酰化修饰motif基序特征分析；
  • 琥珀酰化修饰蛋白的GO功能注释与分类统计；
  • KEGG代谢通路与信号通路富集分析；
  • 亚细胞定位分析与蛋白质结构域富集分析；
  • 琥珀酰化修饰蛋白互作网络（PPI）构建；
  • 目标蛋白琥珀酰化修饰水平的Western Blot验证；
  • 目标修饰位点的PRM/MRM靶向质谱验证。

客户可根据研究目的选择全蛋白质组琥珀酰化修饰组学分析，也可针对特定目标蛋白开展琥珀酰化修饰检测与验证，灵活满足不同深度的科研需求。

检测方法

赖氨酸琥珀酰化修饰分析以“抗体富集+高分辨质谱检测”为核心技术路线，整体实验流程如下：

  • 蛋白提取与定量：采用含蛋白酶抑制剂和去乙酰化酶抑制剂的裂解液对样品进行超声破碎提取，通过BCA法定量测定蛋白浓度；
  • SDS-PAGE电泳质检：对提取蛋白进行电泳检测，评估蛋白完整性与提取质量；
  • 蛋白酶解：以测序级胰蛋白酶对蛋白样品进行酶解，获得肽段混合物；
  • 肽段分级：采用高pH反相色谱（HP-RPLC）对肽段进行分级，降低样品复杂度；
  • 泛琥珀酰化抗体富集：利用偶联抗琥珀酰化赖氨酸抗体的免疫亲和材料，特异性富集含琥珀酰化修饰的肽段；
  • 液质联用检测：富集肽段经纳升反相色谱分离后，进行LC-MS/MS一级二级质谱数据采集；
  • 数据库检索：使用MaxQuant、Proteome Discoverer等软件检索相应物种蛋白数据库，将赖氨酸琥珀酰化修饰（+100.0160 Da）设置为变量修饰，进行位点鉴定与定量计算；
  • 生物信息学分析：对鉴定结果开展motif分析、GO与KEGG富集、亚细胞定位、结构域分析及互作网络构建等深度数据挖掘；
  • 结果验证（可选）：通过Western Blot、免疫沉淀或PRM靶向质谱对关键修饰位点进行验证。

整个流程设置多重质控环节，包括空白对照、随机化上机顺序、平行样分析等，确保定性定量的准确性与实验结果的可重复性。

检测仪器

赖氨酸琥珀酰化修饰分析对仪器分辨率与灵敏度要求较高，本项检测依托的主要仪器设备包括：

  • Orbitrap系列高分辨液质联用系统（如Q Exactive HF、Q Exactive HF-X、Orbitrap Fusion Lumos），用于修饰肽段的高精度鉴定与定量；
  • timsTOF Pro等新型离子淌度质谱仪，提供更深的肽段覆盖与更好的鉴定通量；
  • 三重四极杆质谱仪，用于目标修饰位点的PRM/MRM靶向验证分析；
  • 纳升超高效液相色谱系统（nano-UHPLC），实现肽段的高效分离；
  • 高效液相色谱仪（HPLC），用于肽段高pH反相分级；
  • 垂直电泳系统与转膜系统，用于SDS-PAGE质检及Western Blot验证；
  • 多功能酶标仪，用于蛋白BCA定量测定；
  • 超低温冰箱、高速冷冻离心机、超声破碎仪等配套样品前处理设备。

完善的仪器平台配置与规范的日常维护校准制度，为琥珀酰化修饰数据的准确获取提供了可靠的硬件保障。

应用领域

赖氨酸琥珀酰化修饰分析在生命科学多个研究领域具有广泛应用价值：

  • 疾病机制研究：解析肿瘤代谢重编程、心血管疾病、糖尿病、脂肪肝、炎症性疾病及神经退行性疾病中的琥珀酰化调控机制，寻找疾病相关 biomarker 与潜在治疗靶点；
  • 代谢调控研究：系统研究糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢及线粒体能量代谢过程中关键代谢酶的琥珀酰化调控网络；
  • 微生物与发酵工程：研究工业菌株代谢流调控机制，为菌种理性改造与发酵产物产量提升提供理论依据；
  • 植物科学研究：揭示植物在干旱、高温、盐渍等逆境胁迫及生长发育过程中琥珀酰化修饰的应答规律；
  • 药物研发：围绕SIRT5等去琥珀酰化酶开展小分子调节剂筛选与药效评价，推动靶向翻译后修饰的创新药物开发；
  • 食品与营养科学：探讨营养干预、加工条件对蛋白质琥珀酰化修饰谱的影响，辅助功能食品开发。

随着修饰蛋白质组学技术的不断成熟，赖氨酸琥珀酰化修饰分析正成为解析复杂生命现象、挖掘关键调控节点的重要研究工具。

常见问题

问题一：赖氨酸琥珀酰化修饰分析的检测周期是多久？

赖氨酸琥珀酰化修饰分析的检测周期一般为7-15个工作日。具体周期会受到多种因素影响，包括检测项目的数量与类型、样品数量、实验方法复杂程度、数据采集时长以及生物信息学分析深度等。如果客户在项目进程中提出加急需求，实验室会结合排机情况尽量协调缩短周期，实际交付时间以项目开始前双方确认的方案为准。

问题二：赖氨酸琥珀酰化修饰分析的检测价格是多少？

赖氨酸琥珀酰化修饰分析的费用与多个因素密切相关，例如检测项目的具体内容、所选用的技术路线与定量方式、样品数量、修饰富集策略、质谱上机时长、生物信息学分析深度以及期望的检测周期等。不同研究需求对应的实验方案差异较大，费用也会相应浮动。如您有检测需求，欢迎联系我们的技术支持团队沟通具体项目信息，我们将根据实际情况为您提供专业的方案设计与报价服务。

问题三：赖氨酸琥珀酰化修饰分析测试需要什么资质？

我们旗下拥有CMA和CNAS资质，能力范围覆盖蛋白质组学相关检测项目。依托完善的质量管理体系、经验丰富的专业技术团队以及高分辨质谱等先进仪器设备，实验室能够为赖氨酸琥珀酰化修饰分析提供规范、可靠的技术服务，满足科研与产业客户对数据质量的多层次要求。

问题四：赖氨酸琥珀酰化修饰分析对送样量有什么要求？

由于琥珀酰化修饰在细胞内丰度通常较低，全蛋白质组琥珀酰化修饰组学分析一般建议提供毫克级总蛋白或足量的组织、细胞样品；具体需求与样品类型、目标蛋白丰度及研究方案有关。样品应在采集后迅速液氮速冻并-80℃保存，全程干冰冷链运输，避免反复冻融导致修饰状态改变，详细送样要求可在实验开始前与技术支持确认。

问题五：赖氨酸琥珀酰化修饰分析与乙酰化等其他赖氨酸修饰有何区别？

赖氨酸琥珀酰化修饰在供体分子、化学基团大小和电荷效应上与乙酰化、丙二酰化、巴豆酰化等修饰不同。琥珀酰化引入的是含四个碳的二羧基基团，使赖氨酸侧链由正电荷转变为负电荷，对蛋白质构象和活性影响更为显著；而乙酰化仅中和正电荷。不同修饰之间可能存在串扰与竞争关系，研究时可通过特异性抗体和质谱精确区分各类修饰类型与位点。

问题六：鉴定到的琥珀酰化修饰位点数量一般能达到多少？

琥珀酰化修饰位点鉴定数量与样品类型、物种、蛋白起始量、修饰丰度、质谱仪器灵敏度及数据库质量等多种因素有关。代谢旺盛的组织如肝脏、心脏以及线粒体丰富的样品通常能获得较多的修饰位点鉴定结果，而某些特殊样品的鉴定数量可能相对有限。实验室会通过优化分级策略与富集条件，尽可能提升修饰肽段的鉴定深度与覆盖度。

问题七：质谱鉴定到的琥珀酰化修饰结果如何进行后续验证？

常见的验证方式包括：利用泛琥珀酰化抗体对目标蛋白进行Western Blot检测，观察整体琥珀酰化水平变化；通过免疫沉淀富集目标蛋白后再进行修饰检测；针对特定修饰位点采用PRM或MRM靶向质谱进行定量验证，确认位点鉴定的真实性与差异变化的可靠性。此外，还可以结合点突变实验将修饰位点赖氨酸突变为精氨酸或谷氨酸，从功能层面佐证修饰的生物学意义。