流式细胞术细胞因子检测

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流式细胞术细胞因子检测技术规范

1. 检测范围 流式细胞术细胞因子检测技术适用于多种生物样本中细胞因子的定量分析，包括但不限于血液（血清、血浆）、外周血单个核细胞（PBMC）、细胞培养上清液、组织匀浆液等。该技术可检测的细胞因子涵盖促炎因子、抗炎因子、趋化因子及生长因子等，广泛应用于免疫疾病研究（如自身免疫病、过敏反应）、感染性疾病监测（如脓毒症、病毒感染）、肿瘤免疫治疗评估及疫苗研发等领域。其检测灵敏度可达pg/mL级别，支持多参数同步分析（如同时检测12-30种细胞因子），满足高通量研究需求。

2. 检测项目 常见检测项目根据功能分类如下：

• Th1/Th2/Th17相关因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α；
• 炎症相关因子：IL-1β、IL-8、IL-12p70、IL-18、TNF-β；
• 趋化因子：CCL2（MCP-1）、CXCL8（IL-8）、CXCL10（IP-10）；
• 生长因子：VEGF、GM-CSF、G-CSF、TGF-β1；
• 其他功能因子：IFN-α、IFN-β、IL-21、IL-22。 检测项目可根据实验需求选择单因子或多因子联检试剂盒（如Human Cytokine 30-Plex Panel）。

3. 检测仪器 核心仪器为高性能流式细胞仪，常用型号包括：

• BD FACSymphony™ A5：配置5激光系统，支持40色荧光检测，适用于超多参数细胞因子谱分析；
• Beckman Coulter CytoFLEX SRT：配备3激光（488 nm、638 nm、405 nm），支持21色检测，兼容微球阵列技术；
• Miltenyi Biotec MACSQuant® X：集成全自动样本加载系统，可实现高通量检测（96孔板直接上样）。 配套设备包括：微量振荡器（用于微球-抗体复合物混匀）、高速低温离心机（4℃条件下15,000 ×g离心）、荧光校准微球（如BD™ Cytometric Bead Array校准颗粒）。

4. 检测方法 4.1 样本前处理

• 血清/血浆：采集后30分钟内4℃离心（2,000 ×g，10分钟），分装冻存于-80℃；
• 细胞培养上清：去除细胞碎片（离心300 ×g，5分钟），添加蛋白酶抑制剂（如0.5 mM PMSF）；
• 组织匀浆：按1:5（w/v）比例加入裂解缓冲液，超声破碎后离心取上清。

4.2 实验流程

1. 微球-抗体复合物孵育：将捕获抗体包被的荧光编码微球（如Luminex® MagPlex微球）与待测样本按1:10比例混合，37℃振荡孵育2小时；
2. 检测抗体标记：加入生物素化检测抗体（浓度1 μg/mL），室温避光孵育1小时；
3. 信号放大：添加链霉亲和素-PE偶联物（稀释倍数1:200），孵育30分钟；
4. 流式检测：使用流式细胞仪采集微球荧光信号（如PE通道检测细胞因子浓度，APC/Cy7通道识别微球编码），阈值设定排除直径＜5 μm颗粒；
5. 数据分析：通过标准品梯度（0-10,000 pg/mL）建立四参数逻辑（4PL）曲线，计算样本中各细胞因子浓度（软件：Bio-Plex Manager™ 或FlowCytomix Pro）。

4.3 质控要求

• 每批次实验需包含空白对照（仅检测缓冲液）、阴性对照（同型抗体）、标准品复孔（CV＜15%）；
• 仪器需每日进行CS&T质控（如BD FACSDiva™软件），确保激光稳定性（变异系数CV＜2%）；
• 样本回收率需控制在80-120%范围内。

（注：全文严格遵循非临床研究GLP规范，实验操作需在生物安全二级实验室进行）

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。