酪氨酸酶活反应检测

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酪氨酸酶活性反应检测技术规范

1. 检测范围 酪氨酸酶活性检测适用于医药研发（如黑色素相关疾病药物筛选）、化妆品安全评估（美白产品功效及刺激性评价）、农业研究（果蔬褐变机理分析）及食品工业（加工过程中酶活性控制）等领域。

2. 检测项目

• 酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化反应的活性定量
• 酶促反应动力学参数测定（如Km、Vmax）
• 抑制剂或激活剂对酶活性的影响分析
• 温度、pH等环境因素对酶活性的作用评估

3. 检测仪器

• 紫外-可见分光光度计：用于监测产物多巴醌在475 nm处的吸光度变化（如岛津UV-1800）。
• 酶标仪（多功能型）：支持高通量筛选（如Thermo Scientific Multiskan GO）。
• 恒温水浴锅：维持反应体系温度（精度±0.5℃）。
• 精密pH计：校准反应缓冲液pH值（如METTLER TOLEDO FE28）。
• 离心机：样品前处理（转速≥10,000 rpm）。

4. 检测方法 4.1 样品制备 取待测样品（酶液或含酶组织匀浆），经4℃离心（10,000 rpm，10分钟）后取上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8）稀释至适宜浓度。

4.2 反应体系配置 于比色皿或96孔板中依次加入：

• 1.8 mL PBS（含0.1% Triton X-100）
• 0.1 mL 2 mM L-酪氨酸（底物）
• 0.1 mL待测酶液 立即混匀，37℃恒温反应10分钟。

4.3 吸光度测定 使用分光光度计或酶标仪，每30秒记录475 nm波长下吸光度值（ΔA），持续监测5分钟。以不含酶液的体系作为空白对照。

4.4 活性计算 酶活性单位（U）定义为每分钟催化生成1 μmol多巴醌所需的酶量。根据公式计算： 酶活性(�/��)=Δ�/���×反应体系体积(��)×稀释倍数�×光径(��)酶活性(U/mL)=ε×光径(cm)ΔA/min×反应体系体积(mL)×稀释倍数​ 其中，ε为多巴醌摩尔消光系数（3.6×10^3 L·mol⁻¹·cm⁻¹）。

4.5 质量控制

• 标准曲线法：采用不同浓度多巴醌建立标准曲线（R²≥0.99）。
• 平行实验：每组样品设3次重复，相对标准偏差（RSD）≤5%。

（注：本方法参考《酶学分析技术手册》及改良型比色法优化。）

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。