细胞成瘤性检测

(CMA)     (ISO) (高新技术企业)

细胞成瘤性检测技术规范

一、检测范围

1. 干细胞及其衍生细胞：包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）及分化细胞。
2. 免疫细胞治疗产品：如CAR-T细胞、TCR-T细胞、NK细胞等。
3. 体外长期培养的细胞系：如肿瘤细胞系、永生化细胞系。
4. 基因编辑或工程化改造细胞：涉及CRISPR/Cas9、慢病毒/腺病毒载体修饰的细胞。
5. 再生医学与组织工程产品：如软骨细胞、成纤维细胞等。

二、检测项目

1. 软琼脂克隆形成实验：评估细胞锚点非依赖性生长能力。
2. 裸鼠体内成瘤实验：通过皮下或原位接种检测体内致瘤性。
3. 端粒酶活性检测：分析细胞永生化特征（TRAP法）。
4. 细胞周期调控蛋白检测：包括Cyclin D1、p53、p21等表达水平。
5. 致瘤基因/抑癌基因突变分析：如KRAS、TP53、MYC等基因测序。
6. 染色体核型分析：检测非整倍体、染色体易位等异常。

三、检测仪器

1. 流式细胞仪：用于细胞周期蛋白定量及表面标志物分析（如CD44、CD133）。
2. 荧光定量PCR仪：检测端粒酶活性（TRAP法）及基因表达差异。
3. 显微成像系统：观察软琼脂克隆形态及裸鼠肿瘤组织病理切片（HE染色）。
4. 高通量测序仪：全基因组/exome测序分析基因突变。
5. 超高速离心机：提取细胞裂解液用于Western blot或ELISA。
6. 生物安全型动物实验设备：IVC独立通风笼具、活体成像系统。

四、检测方法

1. 软琼脂克隆形成实验

   • 制备0.5%底层琼脂（含10% FBS），铺于6孔板并固化。
   • 将细胞悬液（密度5×10³/mL）与0.3%顶层琼脂混合，接种于底层琼脂上。
   • 37℃、5% CO₂培养14-21天，倒置显微镜观察＞50μm克隆形成情况。

2. 裸鼠体内成瘤实验

   • 选用4-6周龄BALB/c-nu裸鼠，皮下接种1×10⁶待测细胞（PBS悬浮）。
   • 每周测量肿瘤体积（公式：V=0.5×长径×短径²），持续8周。
   • 解剖后取瘤组织进行HE染色及Ki-67免疫组化分析增殖活性。

3. 端粒酶活性检测（TRAP法）

   • 裂解细胞提取总蛋白，BCA法定量后调整至1μg/μL。
   • 配制TRAP反应体系：含TS引物、ACX引物、dNTP、Taq酶。
   • 荧光定量PCR程序：25℃延伸30min→94℃预变性5min→94℃ 30s→59℃ 30s（40循环）。

4. 细胞周期蛋白检测

   • 70%冷乙醇固定细胞，PI/RNase染色避光孵育30min。
   • 流式细胞术分析G0/G1、S、G2/M期分布及Cyclin D1表达强度。

5. 基因突变分析

   • 设计KRAS、TP53等基因特异性引物，PCR扩增后Sanger测序。
   • 比对NCBI参考序列，使用Chromas软件识别SNP/Indel突变位点。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。