登革热病毒灭活检测

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登革热病毒灭活检测技术概要

检测范围

1. 样本类型：包括临床血清/血浆样本、细胞培养物（如C6/36细胞系培养的登革病毒）、疫苗原液及生物制品（如血浆衍生制品）。
2. 灭活处理后验证：评估化学灭活（β-丙内酯、甲醛）、物理灭活（热处理、紫外线照射）或联合灭活方法的有效性。
3. 应用场景：疫苗生产质量控制、血液制品安全性验证、实验室病毒灭活操作合规性检测。

检测项目

1. 灭活效率：通过病毒滴度测定量化灭活前后病毒活性变化，阈值需符合WHO标准（如灭活后病毒滴度下降≥4 log10）。
2. 残留活性检测：验证灭活后是否存在复制能力病毒颗粒。
3. 病毒核酸残留：检测灭活后游离RNA/DNA残留量（阈值通常≤10^2 copies/mL）。
4. 结构蛋白完整性分析：评估灭活对病毒E蛋白、NS1抗原表位的影响。
5. 免疫原性保留：验证灭活病毒能否诱导特异性中和抗体。

检测仪器

1. 实时荧光定量PCR仪（qRT-PCR）：用于病毒载量及核酸残留定量（设备型号如ABI 7500）。
2. 细胞培养系统：CO2培养箱（37℃±1℃，5% CO2）、倒置显微镜（观察CPE效应）。
3. 病毒滴度检测设备：噬斑分析成像系统、TCID50自动计算软件。
4. ELISA检测平台：全自动酶标仪（波长450/630nm）、洗板机。
5. 蛋白分析设备：Western blot系统、SDS-PAGE电泳仪。
6. 生物安全设备：二级生物安全柜（BSC-II A2型）、高速离心机（配备气溶胶密封转子）。

检测方法

1. 灭活效率评估

   • 噬斑形成试验（Plaque Assay）：将灭活样本接种Vero细胞单层，计算PFU/mL下降值。
   • TCID50终点稀释法：通过细胞病变效应（CPE）判定半数感染量。

2. 残留活性检测

   • 盲传三代法：连续3代接种敏感细胞（如C6/36），观察是否出现CPE。
   • 免疫荧光染色：采用登革病毒特异性单抗检测细胞内病毒复制。

3. 核酸残留检测

   • qRT-PCR定量：针对登革病毒3&39;非编码区设计引物探针（检测限≤50 copies/reaction）。

4. 结构蛋白分析

   • ELISA法：使用抗E蛋白单克隆抗体检测抗原构象变化。
   • SDS-PAGE/Western blot：分析病毒颗粒解聚程度及蛋白降解情况。

5. 免疫原性验证

   • 小鼠免疫试验：检测血清中和抗体效价（PRNT50≥1:40为阳性）。
   • 假病毒中和试验：基于VSV/DENV嵌合病毒系统的体外评估。

质量控制要求

1. 包含灭活组、阳性对照（未灭活病毒）及阴性对照（无病毒样本）三组平行试验。
2. 病毒滴度检测重复3次独立实验，CV值≤15%。
3. 生物安全操作符合WHO《实验室生物安全手册》三级防护标准（针对活病毒检测阶段）。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。