流式检测细胞自噬检测

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流式细胞术检测细胞自噬的实验方案

检测范围

本方法适用于定量分析哺乳动物细胞（如HeLa、HEK293、原代细胞等）的自噬活性，涵盖基础自噬水平、药物诱导（如雷帕霉素、氯喹）或饥饿（如HBSS处理）条件下的自噬动态变化。检测对象包括贴壁细胞和悬浮细胞，样本类型可为细胞培养物或分离的组织细胞。

检测项目

1. 自噬体形成：通过荧光探针（如Cyto-ID® Green染料）特异性标记自噬体膜结构（如LC3-II）。
2. 溶酶体活性：采用LysoTracker® Red DND-99染色溶酶体，评估自噬降解阶段。
3. 自噬相关蛋白表达：使用抗体标记LC3B、p62/SQSTM1等蛋白，分析其表达水平变化。
4. 自噬流动态：结合自噬诱导剂与抑制剂（如巴菲霉素A1），区分自噬体形成与降解效率。

检测仪器

1. 流式细胞仪：
   • 型号：BD FACSCanto™ II（配备488 nm蓝色激光和640 nm红色激光）。
   • 检测通道：
     • FITC通道（530/30 nm）：检测Cyto-ID® Green或LC3B-FITC信号。
     • PE通道（585/42 nm）：检测LysoTracker® Red信号。
     • APC通道（660/20 nm）：检测LC3B-APC或p62抗体标记信号。
   • 数据采集与分析软件：BD FACSDiva™ 8.0.1。

检测方法

1. 样本制备

• 细胞处理：
  • 对照组：正常培养基培养。
  • 诱导组：加入100 nM雷帕霉素（6小时）或HBSS饥饿处理（2小时）。
  • 抑制组：联合巴菲霉素A1（50 nM，预处理1小时）。
• 染色步骤：
  • Cyto-ID®染色：弃培养基，PBS清洗后加入1×Cyto-ID®工作液（37℃避光孵育30分钟）。
  • LysoTracker®染色：加入50 nM LysoTracker® Red（37℃孵育15分钟）。
  • 抗体标记：固定透膜后，加入LC3B抗体（1:200）或p62抗体（1:100），4℃孵育过夜。

2. 流式检测参数设置

• 阈值设定：前向散射（FSC）排除碎片，侧向散射（SSC）区分活细胞。
• 荧光补偿：单染样本调整FITC、PE、APC通道间光谱重叠。
• 采集条件：每样本获取10,000个细胞事件，排除粘连体（FSC-H vs. FSC-A）。

3. 数据分析

• 自噬体定量：Cyto-ID®阳性细胞比例（FITC通道）反映自噬体丰度。
• 溶酶体活性：LysoTracker® Red平均荧光强度（MFI）评估溶酶体酸化水平。
• 自噬流计算：比较雷帕霉素与巴菲霉素A1处理组的LC3B-II/p62比值变化。
• 统计工具：FlowJo® v10.8软件进行门控和MFI计算，GraphPad Prism 9.0生成柱状图。

（注：实验需设置未染色对照、同型抗体对照及死细胞排除染料（如7-AAD）以排除干扰。）

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。