质粒菌种检测

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检测范围

质粒菌种检测主要针对实验室常用宿主菌及重组质粒体系，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等工程菌株，以及pET、pUC、pGEX等常见质粒载体。检测对象涵盖克隆质粒、表达质粒、穿梭质粒等类型，涉及质粒构建、扩增、保存及转染等环节的质量控制。

检测项目

1. 质粒浓度与纯度

通过紫外分光光度法测定A260/A280比值，评估质粒DNA的浓度（ng/μL）及蛋白质污染程度，合格标准为A260/A280值1.8-2.0。

2. 质粒完整性

采用琼脂糖凝胶电泳分析质粒超螺旋结构比例，观察是否存在开环或线性化降解，上样量通常为200-500 ng。

3. 拷贝数测定

通过实时定量PCR（qPCR）检测质粒特异性基因（如amp抗性基因）的Ct值，计算单位菌体内质粒拷贝数，标准菌株拷贝数需符合文献参考范围。

4. 抗生素抗性验证

利用LB平板培养法测试质粒携带的抗生素标记（如氨苄青霉素、卡那霉素）表达活性，接种浓度梯度菌液后观察24小时抑菌圈形成情况。

5. 序列准确性

通过Sanger测序验证目的基因插入位点、启动子区域及多克隆位点的序列正确性，目标区域覆盖率需达到100%，测序深度≥500×。

检测仪器

1. 紫外分光光度计（Nanodrop 2000/OneDrop等）
2. 凝胶成像系统（Bio-Rad ChemiDoc/Tanon系列）
3. 实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7500）
4. 梯度PCR仪（Eppendorf Mastercycler）
5. 全自动核酸测序仪（ABI 3730xl）
6. 高速冷冻离心机（Beckman Coulter Allegra X-30R）
7. 水平电泳槽（Bio-Rad Sub-Cell GT）

检测方法

质粒提取与纯化

采用碱裂解法：菌体经LB培养基扩增后，通过Solution I/II/III裂解并中和，使用硅胶膜吸附柱纯化质粒DNA，最后用无核酸酶水洗脱（操作温度全程保持4℃）。

电泳分析

配制1%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB染料），取5 μL质粒样本与6×Loading Buffer混合后上样，在120 V电压下电泳30分钟，通过凝胶成像系统分析条带形态。

qPCR扩增

设计特异性引物（如靶向ori区域），采用SYBR Green法进行扩增：95℃预变性3分钟，后续40个循环（95℃ 15秒，60℃ 30秒），最后通过标准曲线法计算拷贝数。

抗性功能验证

将质粒转化感受态细胞后，涂布于含对应抗生素的LB平板，37℃培养16小时后统计菌落形成单位（CFU），抗性效率需≥1×10^6 CFU/μg质粒。

测序数据分析

使用Chromas软件读取.ab1格式文件，通过BLAST比对参考序列，要求目的区域匹配度≥99.5%，无移码突变或非预期碱基插入。

注意：因业务调整，暂不接受个人委托测试望见谅。