技术概述
志贺氏菌是一种重要的食源性致病菌，隶属于肠杆菌科，是引起细菌性痢疾的主要病原体。在乳制品生产加工过程中，由于原料乳可能受到环境污染、操作人员带菌或加工环节控制不当等因素影响，志贺氏菌的污染风险始终存在。乳制品志贺氏菌筛查检验是保障乳制品安全的重要技术手段，对于预防食源性疾病传播具有重要意义。
志贺氏菌根据生化反应和抗原特性的不同，可分为四个血清群：A群（痢疾志贺氏菌）、B群（福氏志贺氏菌）、C群（鲍氏志贺氏菌）和D群（宋内氏志贺氏菌）。其中，福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌在我国流行最为广泛。志贺氏菌的致病性主要与其侵袭力、内毒素和外毒素有关，感染后可引起急性肠道传染病，临床表现为发热、腹痛、腹泻、里急后重等症状。
乳制品作为高营养食品，其蛋白质、乳糖和脂肪含量丰富，为微生物生长繁殖提供了良好的基质环境。一旦乳制品受到志贺氏菌污染，在适宜的温度和湿度条件下，细菌可迅速增殖，消费者食用后极易引发食源性疾病暴发。因此，建立科学、规范、高效的志贺氏菌筛查检验体系，对于乳制品生产企业、监管部门和检测机构而言，都具有十分重要的现实意义。
随着检测技术的不断发展，乳制品志贺氏菌筛查检验已从传统的培养鉴定方法逐步向分子生物学检测、免疫学检测等快速检测技术方向发展。目前，国家标准方法与国际标准方法相互衔接，形成了较为完善的技术体系。检验人员可根据检测目的、样品类型、时效要求等因素，选择适宜的检测方案，确保检测结果的准确性和可靠性。
检测样品
乳制品志贺氏菌筛查检验涉及的样品范围广泛，涵盖了乳制品生产、流通、消费等各个环节的产品类型。不同类型的乳制品由于其基质特性、加工工艺和储存条件的差异，在样品前处理和检测方案设计上需要采取针对性的措施。
- 液态乳制品：包括鲜牛乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、发酵乳、调制乳等。液态乳制品水分含量高，微生物易于分散，样品均质化处理相对简单，但也需要注意样品的保存温度和运输条件，防止目标菌株死亡或杂菌过度繁殖。
- 乳粉类产品：包括全脂乳粉、脱脂乳粉、调制乳粉、婴幼儿配方乳粉等。乳粉类产品水分含量低，在检测前需要进行复溶处理，同时要注意复溶过程可能引入的外源性污染，以及乳粉中可能存在的受损细菌的复苏培养。
- 发酵乳制品：包括酸奶、发酵乳、奶酪等。发酵乳制品中乳酸菌数量众多，可能对志贺氏菌的分离鉴定产生干扰，需要选择适当的增菌培养基和选择性分离培养基，抑制背景菌群的生长。
- 奶油及稀奶油：脂肪含量较高，样品前处理时需要考虑脂肪对微生物检测的影响，可能需要采用特殊的均质方法或添加表面活性剂以促进目标菌株的释放和分散。
- 炼乳及乳浓缩物：包括淡炼乳、甜炼乳等产品。高糖或高浓度的基质特性可能影响微生物的生长，需要适当稀释后进行检测。
- 乳基婴幼儿配方食品：针对婴幼儿这一特殊消费群体，产品质量安全要求更为严格，志贺氏菌作为重要的致病菌指标，检测灵敏度和准确性要求更高。
样品采集是检测工作的首要环节，直接影响检测结果的代表性。采样人员应遵循无菌操作原则，使用灭菌容器和采样器具，避免样品在采集过程中受到污染。样品应标明名称、批号、采样日期、采样地点等信息，并在规定的温度条件下尽快送至实验室检测。对于易变质样品，应在冷藏条件下运输，但不宜冷冻，以免影响志贺氏菌的活性。
检测项目
乳制品志贺氏菌筛查检验的核心检测项目是对样品中是否存在志贺氏菌进行定性和定量分析。根据国家标准和相关法规要求，乳制品中志贺氏菌属于不得检出的致病菌指标，检测结果的判定以是否检出为依据。
在定性检测方面，主要确认样品中是否携带志贺氏菌属的细菌。检测过程包括增菌培养、分离纯化、生化鉴定和血清学鉴定等步骤，最终判断样品中志贺氏菌的存在与否。对于阳性结果，需要进一步确定志贺氏菌的血清型别，为流行病学调查和溯源分析提供依据。
- 志贺氏菌定性检测：判定样品中是否存在志贺氏菌，结果报告为"检出"或"未检出"。
- 菌种鉴定：对分离到的可疑菌株进行生化特性鉴定，确认是否为志贺氏菌属。
- 血清分型：采用凝集试验方法，确定志贺氏菌的血清群和血清型，包括A群、B群、C群、D群的鉴别。
- 药敏试验：对分离的志贺氏菌菌株进行药物敏感性检测，了解其耐药谱，为临床治疗和耐药性监测提供参考。
- 分子分型：必要时采用脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型等分子生物学技术，对菌株进行分子分型分析，用于暴发调查和溯源研究。
定量检测方面，虽然国家标准对乳制品中志贺氏菌的限量要求为不得检出，但在某些特定情况下，如食品安全事故调查、科学研究等，可能需要对志贺氏菌进行计数分析。最可能数法和平板计数法是常用的定量检测方法，可估算样品中志贺氏菌的含量水平。
检测方法
乳制品志贺氏菌筛查检验方法经过多年的发展和完善，已形成以国家标准方法为主、行业标准方法和快速检测方法为补充的技术体系。检测人员应根据检测目的、样品类型、时限要求和资源条件等因素，合理选择检测方法。
国家标准方法是乳制品志贺氏菌检测的权威依据，具有较强的法律效力和技术规范性。我国现行有效的国家标准方法主要参照食品安全国家标准中关于志贺氏菌检验的规定执行。该方法采用前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清学鉴定的技术路线，检测周期通常需要4至7天。
前增菌是检测的重要环节，目的是使受损或处于应激状态的志贺氏菌恢复活性。常用前增菌培养基为缓冲蛋白胨水，在适宜的温度下培养一定时间，使样品中的细菌得到初步增殖。对于乳制品样品，前增菌过程还能使样品基质得到稀释，减少抑菌物质的干扰。
选择性增菌在前增菌基础上进行，目的是抑制杂菌生长，促进志贺氏菌的选择性增殖。常用的选择性增菌培养基包括志贺氏菌增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液等。选择性增菌培养基中含有胆盐、煌绿等抑菌物质，可抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌的生长，同时为志贺氏菌提供适宜的营养环境。
分离培养是将增菌液接种于选择性分离培养基上，通过菌落形态观察挑取可疑菌落。常用的选择性分离培养基包括木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂、麦康凯琼脂、沙门氏志贺氏菌琼脂等。志贺氏菌在这些培养基上呈现典型的菌落特征，如不发酵乳糖、透明或半透明的小菌落等。
生化鉴定是对可疑菌落进行一系列生化试验，根据代谢特性判断是否为志贺氏菌。常用的生化试验包括三糖铁琼脂试验、葡萄糖产酸产气试验、硫化氢试验、脲酶试验、靛基质试验、枸橼酸盐利用试验、动力试验等。志贺氏菌的典型生化特征为：三糖铁琼脂底层产酸、斜面产碱、不产硫化氢、不产气，无动力，不利用枸橼酸盐，大多数血清型靛基质阴性。
血清学鉴定是采用已知抗体与分离菌株进行凝集试验，确定志贺氏菌的血清群和血清型。血清学鉴定对于流行病学调查和溯源分析具有重要意义，不同血清型的志贺氏菌在致病性、耐药性和地理分布上可能存在差异。
- 传统培养法：按照国家标准规定的前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定、血清学鉴定流程进行，检测周期较长，但结果准确可靠。
- 聚合酶链式反应法：针对志贺氏菌特异性基因序列进行扩增检测，可在较短时间内获得检测结果，灵敏度高，特异性强。
- 酶联免疫吸附法：利用抗原抗体特异性结合的原理，采用酶标记抗体检测志贺氏菌，操作相对简便，适用于大批量样品的筛查。
- 胶体金免疫层析法：基于免疫层析原理的快速检测方法，可在数小时内得出结果，适用于现场快速筛查。
- 全自动微生物鉴定系统：结合生化反应数据库和先进的仪器分析技术，实现菌种的自动化鉴定，提高检测效率和准确性。
快速检测方法在近年得到快速发展，分子生物学技术和免疫学技术的应用，显著缩短了检测时间。聚合酶链式反应技术可在数小时内完成志贺氏菌的特异性基因检测，灵敏度可达到检测限要求。实时荧光定量聚合酶链式反应技术还可实现定量分析。等温扩增技术无需热循环设备，更适合现场快速检测。免疫学方法如酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析等，操作简便，检测速度快，适用于基层实验室和现场筛查。
在选择检测方法时，应综合考虑检测目的、样品特性、设备条件、人员能力和时间要求等因素。对于法规监管检测和仲裁检测，应优先采用国家标准方法；对于日常监控和企业自检，可采用经验证的快速检测方法；对于阳性结果确认和复杂样品检测，建议采用多种方法相互验证，确保结果的准确性。
检测仪器
乳制品志贺氏菌筛查检验涉及多种仪器设备，这些设备的性能状态直接影响检测结果的准确性和可靠性。实验室应配备满足检测工作需要的仪器设备，并建立完善的设备管理维护制度，确保仪器设备处于良好工作状态。
- 恒温培养箱：用于微生物培养的温度控制设备，根据培养要求可设置不同温度，常用温度包括36℃±1℃、42℃等。培养箱应具有稳定的温度控制系统，温度均匀性和波动性符合要求。
- 生物安全柜：为检测操作提供局部无菌环境和生物安全防护，防止操作过程中的气溶胶扩散和交叉污染。根据防护级别可分为不同类型，微生物检测常用二级生物安全柜。
- 高压蒸汽灭菌器：用于培养基、器皿和废弃物的灭菌处理，是微生物实验室的必备设备。灭菌效果需定期验证，确保达到规定的灭菌温度和时间。
- 光学显微镜：用于细菌形态观察和初步鉴定，包括普通光学显微镜和相差显微镜等类型。显微镜应保持清洁，镜头无霉变，光源充足稳定。
- 离心机：用于样品的前处理和菌体收集，根据转速要求可选择不同类型的离心机。离心过程中应注意配平，防止转子损坏。
- 均质器：用于固体或半固体样品的均质处理，使微生物从样品基质中充分释放。常用的均质方式包括拍打式均质、漩涡振荡均质等。
- 菌落计数器：用于平板菌落的计数分析，分为手动计数器和自动菌落计数仪。自动菌落计数仪可提高计数效率和准确性。
- 生化鉴定系统：用于细菌生化特性的自动化分析，包括半自动和全自动微生物鉴定系统。系统应定期校准和维护，鉴定数据库及时更新。
- 聚合酶链式反应仪：用于分子生物学检测的核酸扩增设备，包括普通聚合酶链式反应仪和实时荧光定量聚合酶链式反应仪。仪器应定期维护，温度控制精度符合要求。
- 电泳系统：用于核酸或蛋白质的电泳分析，包括水平电泳槽、垂直电泳槽和配套的电源设备。电泳系统应与成像分析系统配套使用。
- 酶标仪：用于酶联免疫吸附试验的光密度检测，可实现对微孔板的快速读取和数据分析。仪器波长范围应覆盖常用检测波长。
仪器设备的管理是检测质量控制的重要组成部分。实验室应建立仪器设备档案，记录设备的基本信息、校准情况、维护保养记录和使用记录等。关键仪器设备应定期进行期间核查，确保设备在两次校准之间的性能稳定。对于需要计量的仪器设备，应由具备资质的计量机构进行检定或校准，取得有效的计量证书。
应用领域
乳制品志贺氏菌筛查检验的应用领域广泛，涵盖了乳制品产业链的各个环节，为食品安全监管、质量控制、风险评估和应急处置提供技术支撑。
在食品安全监管领域，市场监管部门对乳制品开展日常监督抽检和风险监测，将志贺氏菌作为重要的致病菌指标纳入检测范围。检测数据为监管部门评估乳制品安全状况、发现问题隐患、制定监管措施提供科学依据。在食品安全标准制修订过程中，检测结果和数据积累为限量标准和方法标准的制定提供参考。
- 乳制品生产企业：原料乳验收、生产过程监控、成品出厂检验等环节开展志贺氏菌筛查检验，确保产品质量安全。企业通过建立完善的检验体系，实现对产品质量的全程控制，及时发现和消除安全隐患。
- 乳制品进口检验：出入境检验检疫机构对进口乳制品实施检验检疫，志贺氏菌是重要的检验项目。检验合格的进口乳制品方可进入国内市场销售，检验不合格产品依法进行退货或销毁处理。
- 食品安全事故调查处理：在乳制品相关食源性疾病暴发事件的调查中，志贺氏菌筛查检验是查找致病因子、追溯污染来源的关键技术手段。检测结果为事故定性和责任认定提供证据支持。
- 科研院所：开展志贺氏菌的生态分布、污染规律、耐药机制、检测技术等方面的研究，推动检测方法的创新和完善。研究成果为标准制修订和监管决策提供科学依据。
- 食品生产经营许可：在乳制品生产企业许可审查过程中，志贺氏菌检验能力是检验机构资质认定和企业实验室能力考核的重要内容。
- 产品认证：乳制品质量认证过程中，志贺氏菌等致病菌指标是重要的认证检验项目，检测合格是获得认证证书的必要条件。
在乳制品生产企业中，志贺氏菌筛查检验贯穿于原料验收、生产过程控制和成品检验等关键环节。原料乳的卫生质量直接影响终产品的安全，企业对原料乳进行志贺氏菌检验，可有效把控原料源头风险。生产过程中，通过对设备表面、环境空气、操作人员手部等进行监测，评估生产环境的卫生状况。成品检验是企业放行产品的最后一道关口，确保出厂产品符合食品安全标准要求。
在食品安全风险评估领域，通过持续开展乳制品志贺氏菌污染状况监测，积累检测数据，分析污染水平和分布特征，评估消费者暴露风险，为制定风险管理措施和消费指导提供依据。风险评估结果可为食品安全标准的修订、监管重点的确定和风险交流提供技术支撑。
常见问题
乳制品志贺氏菌筛查检验过程中，检测人员可能遇到各种技术和操作层面的问题。以下针对常见问题进行分析解答，为检测工作提供参考和指导。
- 样品前处理时应注意哪些问题？乳制品样品类型多样，前处理方法需要根据样品特性进行调整。液态乳制品应充分摇匀后取样，乳粉类产品需使用无菌水或缓冲液复溶，发酵乳制品应注意乳酸菌的干扰，高脂肪样品需考虑脂肪对检测的影响。前处理过程应在无菌条件下进行，避免外源性污染。
- 志贺氏菌增菌培养的条件如何选择？志贺氏菌增菌培养通常采用两步法，即先进行前增菌，再进行选择性增菌。前增菌温度一般为36℃±1℃，培养时间16至20小时；选择性增菌温度可根据培养基类型确定，培养时间通常为18至24小时。增菌时间不宜过长，否则可能影响目标菌株的活性或导致杂菌过度繁殖。
- 如何提高志贺氏菌分离培养的阳性率？选择合适的分离培养基是提高阳性率的关键。建议同时使用两种以上选择性差异的分离培养基，以提高检出概率。接种前增菌液时应取液面与培养基界面处的培养物，该处细菌密度较高。可疑菌落应多挑取几个进行鉴定，避免遗漏。
- 志贺氏菌与大肠埃希氏菌如何鉴别？志贺氏菌与大肠埃希氏菌在生化特性上存在一定相似性，需要通过多项生化试验进行鉴别。志贺氏菌无动力、不产气、不利用枸橼酸盐、赖氨酸脱羧酶阴性，而大肠埃希氏菌通常有动力、产气、部分菌株可利用枸橼酸盐、赖氨酸脱羧酶多为阳性。血清学凝集试验也可用于鉴别。
- 志贺氏菌血清学鉴定不凝集怎么办？志贺氏菌血清学鉴定时可能出现不凝集现象，可能原因包括菌株表面抗原被遮蔽、抗原表达量不足、存在自凝现象或菌株变异等。可尝试将菌液煮沸处理后进行凝集试验，或采用不同厂家血清试剂进行验证，必要时进行分子生物学鉴定。
- 快速检测方法阳性结果如何确证？采用快速检测方法获得阳性结果后，应使用国家标准方法进行确证试验。确证试验应从原始样品开始重新检测，按照标准方法完成全部检测流程，以确证结果作为最终报告依据。
- 检测过程中如何实现质量控制？质量控制贯穿检测全过程，包括培养基质量控制、试剂质量验收、仪器设备校准、环境监测、阳性对照和阴性对照设置、平行样检测等。实验室应建立质量控制程序，定期开展内部质量控制和外部质量评价活动。
- 检测结果报告应注意哪些问题？检测报告应准确、清晰、客观地反映检测情况和结果。报告内容包括样品信息、检测依据、检测方法、检测结果、判定依据、检测人员和审核人员等。对于阳性结果，应注明志贺氏菌的血清型别；对于阴性结果，应注明检测限。报告签发前应经过技术审核，确保信息准确无误。
乳制品志贺氏菌筛查检验是保障乳制品安全的重要技术手段。检测人员应掌握扎实的专业理论知识和熟练的操作技能，严格按照标准方法和操作规程开展检测工作。检测机构应建立完善的质量管理体系，确保检测结果的准确可靠，为乳制品质量安全保驾护航。
